Sprouse, 4 Ağustos 1992'de Arezzo, Toskana, İtalya'da Amerikalı ebeveynler Melanie (Wright) ve Matthew Sprouse'un çocuğu olarak dünyaya geldi. Dylan ve küçük tek yumurta ikizi Cole Sprouse ailelerinin Long Beach, Kaliforniya'daki evinde büyüdü. Altı aylıkken Cole ile birlikte oyunculuğa başlayan Dylan, NYU'dan lisans derecesini aldıktan sonra yeni evi NYC'de oyunculuğa devam etmektedir. Oyunculuğun yanı sıra Dylan, Brooklyn, Williamsburg'da bir bal likörü imalathanesi ve bar sahibi ve işletmenin usta bira üreticisi olarak hizmet veriyor.