Kült film hayranları tarafından en çok İtalyan B-filmlerindeki rolleriyle tanınsa da Donald O'Brien Fransa'nın Pirene dağlarındaki Pau'dan geliyordu. İrlandalı babası İspanyol-Amerikan savaşında savaşmış eski bir ABD Ordusu Calvary subayı, annesi ise İngiliz bir mürebbiyeydi. İkinci Dünya Savaşı patlak verdiğinde ve Fransa Nazi işgali altına girdiğinde, O'Brien'lar Donald'ın gelişim yıllarını geçireceği İrlanda'ya geri kaçtı. İrlandalı tiyatro efsanesi Micheál MacLiammóir'in yanında oyunculuk eğitimi aldı ve daha sonra Fransa'ya geri dönerek boksörlük ve ofis işçiliği gibi çeşitli işlerde çalıştı.1953'te 23 yaşındaki O'Brien ilk kez bir sinema filminde, Anatole Litvak'ın savaş draması Bir Aşk Böyle Bitti (1953) filminde rol aldı. Yönetmen John Frankenheimer ile tesadüfen karşılaşan O'Brien, Tren (1964) filminde bir Nazi subayını canlandırdı ve yönetmeni o kadar etkiledi ki Ölümle yarışanlar (1966) filminde yardımcı rolde oynadı. 1967'de O'Brien, Sergio Sollima'nın kült Spagetti Western filmi Serseriler kralı'nda (1968) rol alması için İtalya'ya getirildi. Eski bir Amerikan kanun adamından servet sahibi bir askere dönüşen Nathaniel Cassidy'yi canlandırdığı bu film, birkaç yıl boyunca bu türde başrol oynamasına yol açtı ve bu sırada sözleşmelerde sık sık yanlış yazıldığı için adını "Donal" yerine "Donald" olarak değiştirdi.O'Brien kısa sürede İtalyan B-filmlerinin vazgeçilmezi haline geldi ve Spagetti Western'lerden korku filmlerine ve Sexploitation filmlerine kadar her şeyde rol aldı. 1981'de Zombi Holocaust (1980) (ABD'de gösterime girdiğinde 'Doctor Butcher, M.D.' olarak yeniden adlandırıldı) filminde rol aldı ve filme adını veren çılgın bilim adamını canlandırarak korku ve istismar filmi hayranları arasında güçlü bir kült haline geldi. Ancak aynı yıl vücudunun yarısını felç eden bir beyin hasarı geçirdi ve iyileştikten sonra bile oynayabileceği rollerin sayısını önemli ölçüde azalttı. Kötü şöhretli Joe D'Amato için birkaç filmde rol aldı ve Jean-Jacques Annaud'nun Gülün Adı (1986) filminde Sean Connery'nin karşısında bir Fransisken rahibi olarak yardımcı bir rol üstlendi. 1996'da geçirdiği bir başka kazanın ardından, O'Brien oyunculuktan emekli oldu ve ailesiyle birlikte Paris'e yerleşti.